Sistemul imun asigură mecanismele răspunzătoare de menţinerea (apărarea) integrităţii organismului în faţa agresiunii microorganismelor şi a altor antigene.
Principala funcţie a sistemului imun este aceea de a preveni sau de a limita infecţia produsă de microorganisme cum ar fi bacteriile, virusurile, fungii, paraziţii.
Protecţia este asigurată, în primul rând de mecanisme mediate celular, umoral ale sistemului imun, cât şi sistemul Complement şi celulele fagocitare.
DIAGNOSTICUL IMUNOLOGIC poate fi împărţit în:
A. REACŢII ANTICORP-ANTIGEN
B. TESTE PENTRU EVALUAREA IMUNITĂŢII MEDIATĂ CELULAR
A. REACŢIILE ANTICORP-ANTIGEN
Reacţiile antigenelor cu anticorpii prezintă o mare specificitate. Un antigen va reacţiona doar cu anticorpul a cărui sinteză a fost indusă de el sau de un alt antigen cu structură apropiată.
Datorită gradului ridicat de specificitate, reacţiile dintre antigene şi anticorpi pot fi utilizate pentru identificarea unuia dintre componente. Există două situaţii:
1. Identificarea unui antigen (Ag) necunoscut izolat din proba de cercetat, folosind seruri standard (Ab) (care sunt seruri obţinute de la animale imunizate cu antigene purificate cunoscute).
Ag + Ac Ag - Ac
2. Evidenţierea anticorpului specific (Ac) din serul unui pacient, utilizând antigenele standard (diagnosticul serologic).
Ag + Ab Ag - Ac
Antigene şi anticorpi: definiţii de bază
Antigenele sunt substanţe care pot fi recunoscute şi dependente de sistemul imun, în timp ce imunogenii sunt molecule care induc un răspuns imun.
În majoritatea cazurilor, antigenele sunt imunogene, astfel încât se utilizează ambii termeni. Însă, există câteva excepţii cu importanţă deosebită, cum sunt haptenele. O haptenă este o moleculă care nu e imunogenă prin ea insăşi, dar poate reacţiona cu anticorpul specific.
Un epitop (determinantul antigenic) este structură moleculară care interacţionează practic cu o singură moleculă de anticorp. Antigenele şi imunogenii conţin de obicei, mai mulţi epitopi, fiecare dintre ei fiind capabil să se lege de o moleculă de anticorp diferit.
Anticorpii sunt imunoglobuline care reacţionează specific cu antigenul care a stimulat producerea lor. Ei reprezintă 20% din proteinele plasmei sanguine.
Anticorpii pot fi utilizaţi ca elemente sensibile şi specifice pentru detectarea, identificarea şi dozarea antigenelor.
Anticorpii specifici pot fi obţinuţi de la pacienţi în perioada de convalescenţă a anumitor afecţiuni (de exemplu, anticorpii antivirali) sau pot fi purificaţi de la animale imunizate cu antigenul care ne interesează.
Un tip special de anticorpi, utilizaţi în scopuri diagnostice, sunt anticorpii monoclonali care recunoaşte un singur epitop, de aceea aceşti anticorpi au o mare specificitate
Anticorpii monoclonali în special pentru antigenele de suprafaţă ale limfocitelor, se prepară pentru a fi comercializate. Datorită faptului că anticorpii monoclonali au revoluţionat atât de profund metodele de detectare a antigenelor, producerea acestor molecule va fi prezentată ulterior.
Un alt tip de anticorpi, sunt anticorpii policlonali, care sunt preparate heterogene de anticorpi, capabili să recunoască mai multe tipuri de epitopi ai unui antigen.
Reacţii Ag - Ac utilizate în diagnosticul imunologic
I. In vitro: 1. Reacţia de aglutinare (în care antigenul este particulat)
2. Reacţia de precipitare (în care antigenul este solubil)
3. Reacţia de fixare a complementului
4. Reacţia de neutralizare
5. Imunofluorescenţa (IF), testul ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), Radioimunotestarea (Radioimmunoassay - RIA).
II. In vivo: Intradermoreacţii (teste cutanate)
1. Prick - testul cutanat
2. Patch - testul cutanat
I. In vitro
1. Reacţia de aglutinare
În această reacţie, antigenul este particulat (de exemplu, bacterii sau eritrocite) sau este o particulă inertă (de latex) învelită cu un antigen.
Anticorpul, fiind bivalent sau multivalent, se leagă de particulele antigenice multivalente şi formează o reţea, reacţia de aglutinare devenind vizibilă.
Tehnica este sensibilă şi poate fi aplicată atât pentru antigene dar şi moleculele de anticorpi.
1.a Aglutinarea directă implică aglutinarea particulelor antigenice (cum sunt bacteriile sau fungi) cu participarea anticorpilor specifici.
Determinarea antigenului
Bacteriile sunt identificate în mod obişnuit, preparând din cultura pură o suspensie lichidiană pe o lamă de sticlă sau în tuburi şi urmărind dacă acestea sunt aglutinate sub forma unor agregate vizibile, în urma adăugării de antiseruri specifice care au fost obţinute ca răspuns la antigene bacteriene cunoscute.
Determinarea anticorpului
Suspensia de bacterii de această data cunoscute, poate fi utilizată invers, pentru determinarea şi dozarea anticorpilor serici.
Se efectuează prin testarea pe o serie de diluţii de ser a unei suspensie bacteriane standard şi determinarea celei mai mari diluţii de ser la care încă este prezentă reacţia de aglutinare (care reprezintă titrul reacţiei).
Reacţia de aglutinare are sensibilitate mai mare decât reacţia de precipitare.
1b. Aglutinarea pasivă
În ceea ce priveşte aglutinarea pasivă, pot fi detectate antigenele sau anticorpii, în funcţie de reactantul legat de carrier.
Antigene cunoscute legate de carrier, pentru determinarea anticorpului
În această situaţie, antigenul este particulat având astfel particularitatea de a fi aglutinabil. Legarea de carrier este posibilă prin fixarea antigenelor solubile la suprafaţa unor particule care din punct de vedere immunologic sunt inerte.
De exemplu, numeroase polizaharide aderă uşor, dar ferm la suprafaţa eritrocitelor spălate; numeroase antigene proteice aderă în mod similar la hematii tratate cu diferiţi agenţi, ori la particulele de polistiren, latex, bentonită, colodiu, cărbune.
Determinarea anticorpilor antivirus rubeolic prin reacţia de aglutinare pe latex este realizată prin amestecarea antigenelor imunodominante de rubella virus fixate pe particulele de latex, cu probe de ser şi urmărirea apariţiei reacţiei de aglutinare (fig. 38).
..................................
Fig. 38 - Detectarea anticorpilor de rubella prin aglutinare pe latex
..................................
Determinarea antigenului
Particulele de latex acoperite cu anticorpi specifici sunt aglutinate în prezenţa unui antigen omolog (fig. 39).
În practică acest test este folosit pentru determinarea:
- Factorului reumatoid (FR) care este o proteină care apare în mod patologic, având proprietăţile clasei IgM, care apare în serul pacienţilor cu artrită reumatoidă. Această proteină mai poate apare şi în cazul altor afecţiuni: lupus eritematos, sindrom Sjögren, boli hepatice, tuberculoză, sifilis, infarct miocardic chiar şi la persoane sănătoase (mai ales la vârstnici);
- Proteina C reactivă (PCR) în serul persoanelor sănătoase este prezentă în concentraţii minime (foarte dificil de detectat prin tehnici obişnuite). Proteina C reactivă este una dintre "proteinele de fază acută" a cărei concentraţie creşte în decursul proceselor inflamatorii acute, în fazele de reactivare ale inflamaţiilor cronice şi în procesele necrotice (infarct miocardic, tumori maligne);
- Determinarea directă a antigenului streptococului de grup A din tampoanele faringiene este realizată prin tratarea probei fie la pH scăzut (cu acid azotic) fie cu diferite enzime; ulterior se pune în contact lichidul extras, cu particule de latex acoperite cu anticorpi anti-streptococ de grup A.
...................................
Fig. 39 - Detectarea antigenului prin aglutinarea pe latex
........................................
1c. Reacţia de coaglutinarea este utilizată, în special în detectarea antigenelor diferitelor grupuri de steptococi, Neisseria meningitidis şi Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae etc.
Anumite tulpini de Staphylococcus aureus (tulpina Cowan, ATCC 12498) prezintă un conţinut ridicat de proteină A de suprafaţă. Proteina A din peretele celular al stafilococului aureu se leagă de fragmentul Fc al moleculei de imunoglobulină, lăsând liber fragmentul Fab pentru legarea antigenului. Aglutinarea vizibilă a stafilococilor reprezintă un test pozitiv care indică legătura antigen-anticorp (fig. 40).
...................................
Fig. 40 - Coaglutinarea
...................................
Particulele de latex acoperite cu anticorpi specifici servesc ca bază pentru multe sisteme disponibile în comerţ, folosite pentru detectarea directă a antigenelor bacteriene. Una dintre aplicaţiile importante este identificarea antigenelor capsulare solubile în cazul mai multor agenţi etiologici ai meningitei acute sau cronice, şi anume: Haemophylus influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis, streptococii de grup B, E.coli şi Cryptococcus neoformans.
1d. Hemaglutinarea
Testul hemaglutinării active identifică anticorpii pentru antigenele eritrocitare. Anticorpul este diluat succesiv în ser fiziologic şi apoi depus în godeurile plăcii de hemaglutinare. Sunt utilizaţi întotdeauna martori pozitivi şi negativi.
Se adaugă în fiecare godeu o suspensie de eritrocite (care conţine o proteină ce prevene aglutinareai nespecifică a hematiilor).
În cazul în care există suficienţi anticorpi pentru a produce aglutinarea vizibilă (prin cross-reacţii/reacţii încrucişate) celulele se vor depune la fundul godeului, sub forma unui covor neomogen.
Daca anticorpii sunt insuficienţi, celulele se vor rostogoli pe pereţii oblici ai plăcii, formând un "buton" roşu pe fundul godeului (fig. 41).
...................................
Fig. 41 - Reacţia de hemaglutinare
...................................
Unii anticorpi nu au capacitatea de a aglutina direct hematiile şi pot fi detectaţi numai cu ajutorul testului de aglutinare indirectă; această reacţie are loc prin adăugarea unui al doilea anticorp (cu proprietăţi hem-aglutinante) care se leagă de anticorpul neaglutinant, ataşându-l astfel (indirect) de eritrocit.
Factorul reumatoid (FR) poate fi evidenţiat în serul pacienţilor folosind reacţia de hemaglutinare: hematiile sensibilizate de berbec, sunt aglutinate în prezenţa factorului reumatoid (reacţia Waaler-Rose).
Reacţia de hemaglutinarea cu participarea virusuri:
Unele virusuri, de exemplu virusul gripal, paragripal, urlian, adenovirusul şi virusul febrei galbene pot produce aglutinarea eritrocitelor umane, precum şi a eritrocitelor de cocoş, por de Guineea, şoarece şi alte animale.
Această reacţie este utilizată pentru detectarea şi titrarea virusurilor hemaglutinante în materialele de cultură.
Pe de altă parte, inhibarea reacţiei de hemaglutinare poate fi folosită pentru decelarea anticorpilor în probele de ser. Aceasta este cunoscută ca testul inhibării hemaglutinării virale (HAI).
Prin legarea covalentă sau necovalentă de diferitele antigene de pe suprafaţa hematiei, utilitatea testului poate fi extinsă şi la detectarea anticorpilor pentru alte antigene decât cele aflate pe hematii.
1e. Testul Coombs
Testul Coombs mai este cunoscut ca testul antiglobulinic. În multe cazuri de anemie hemolitică (de exemplu în boala hemolitică a nou-născutului /incompatibilitate de Rh şi anemii hemolitice determinate de medicamente) anticorpii sunt legaţi pe suprafaţa eritrocitului. Aceste imunoglobuline pot fi evidenţiate prin testul Coombs antiglobulinic direct, în care antiserul anti-imunoglobulină umană este folosit pentru aglutinarea hematiilor de la pacient (fig. 42).
...................................
Fig. 42 - Testul Coombs direct
...................................
În unele cazuri, cantitatea de anticorpi legaţi este prea mică pentru a fi detectaţi prin testul Coombs direct şi se recurge la testul antiglobulinic indirect pentru evidenţierea anticorpilor în serul pacientului. În acest test, serul de la pacient este amestecat cu eritrocite normale şi se adaugă antiser anti-imunoglobulină umană. Dacă anticorpii sunt prezenţi în ser, se produce reacţia de aglutinarea (fig. 43).
...................................
Fig. 43 - Testul Coombs indirect
..................................
2. Reacţia de precipitare
În această reacţie, antigenul se află în soluţie. Tehnicile de precipitare sunt bazate pe:
- capacitatea majorităţii anticorpilor de a interacţiona cu mai mult de un epitop al unei proteine sau agent infecţios
- faptul că fiecare moleculă de anticorp interacţionează cu mai mult de un antigen (de exemplu, imunoglobulina G are două domenii pentru legarea antigenului).
Între anumite limite ale concentraţiei antigenului şi anticorpului (zona de echivalenţă) anticorpul leagă încrucişat antigenul într-un complex prea mare pentru a sta în soluţie (suspensie) şi, de aceea precipită, iar supernatantul nu conţine în exces nici anticorpi, nici antigene.
În zona excesului de anticorpi, există o cantitate prea mare de anticorpi pentru formarea eficientă a unei reţele de legături, iar precipitarea este mai redusă faţă de intensitatea din zona de echivalenţă.
În zona excesului de antigene, toţi anticorpii sunt combinaţi, dar precipitarea este redusă, deoarece complexe antigen-anticorp sunt prea mici pentru a precipita, ele rămân solubile (fig. 44).
...................................
Fig. 44 - Reacţia de precipitare
...................................
Reacţiile de precipitare pot avea loc în soluţie sau în mediu semisolid (agar).
A. Precipitarea în soluţie
a) Reacţia de precipitare inelară
Antigenul şi serul sunt puse în contact în tuburi capilare, astfel încât să nu se amestece, dar să se păstreze interfaţa limpede. Rezultatul pozitiv este dat de apariţia unui precipitat alb la nivelul interfeţei, după 15-20 minute (Figura 45).
...................................
Fig. 45 - Reacţia de precipitare inelară
..................................
Reacţia poate fi utilizată în:
- industria alimentară - la diferenţierea originii cărnii;
- medicina legală - la identificarea originii petelor de sânge;
- diagnosticul microbiologic:
pentru gruparea streptococilor;
reacţia Ascoli - folosită în diagnosticul retrospectiv al antraxului;
reacţia Vincent-Bellot - utilizată în diagnosticul infecţiilor meningococice.
b) Precipitarea în tub capilar
Acest test este efectuat pentru detectarea proteinei C reactive (PCR) (fig. 46).
...................................
Fig. 46 - Reacţia de precipitare în tub capilar
...................................
B. Precipitarea în gel de agar
Poate fi simplă sau dublă difuzie. De asemenea, poate avea loc în prezenţa unui câmp electric.
Difuzia simplă sau imunodifuzia radială (RID) este o metodă cantitativă pentru antigene care pot precipita. În această tehnică, anticorpul este încorporat într-un strat subţire de agaroză, în timp ce antigenul proteic difuzează din godeul în care a fost inoculat.
Acolo unde concentraţia antigenului este optimă pentru a produce reacţia de precipitare, apar inele albe. Diametre mai mari ale acestora indică o concentraţie crescută de antigen.
Aceasta este o metodă destul de sensibilă, putând detecta 1 - 10 µg de proteină şi nu necesită antigen pur pentru determinarea concentraţiei.
Durata tehnicii este de 24 - 48 ore şi indică doar prezenţa, nu şi funcţia proteinelor.
Imunodifuzia radială este utilizată pentru măsurarea IgA, IgM, IgG, componentelor complementului (C3), transferine şi altor substanţe din ser (IgE nu pot fi măsurate deoarece concentraţia lor este prea scăzută) (fig. 47).
...................................
Fig. 47 - Imunodifuzia radială simplă
..............................
Dubla difuzie - metoda Ouchterlony
În această metodă, antigenul şi anticorpul sunt plasate în godeuri diferite efectuate în gelul de agar; cele două componente pot difuza unul spre celălalt, cu scopul stabilirii gradientului de concentraţie a fiecăruia.
Acolo unde se atinge concentraţia optimă, apar liniile de precipitare. Pe baza modelului liniilor de precipitare, acest test poate fi utilizat, de asemenea, pentru a determina daca probele sunt identice, dacă participă sau nu toţi epitopii (identitate parţială) sau dacă probele sunt diferite (fig. 48).
Această tehnică se foloseşte pentru detectarea: proteinei C reactive, antigenului HBs, antigenului carcino-embrionar (care apare în unele tipuri de cancer), produşilor de degradare ai fibrinogenului, antigenelor fungice (de exemplu: Histoplasma spp., Blastomyces spp., Coccidioides) etc.
...................................
Fig. 48 - Imunodifuzia dublă
...................................
C. Precipitarea în gel de agar cu ajutorul câmpului electric
Electroforeza reprezintă metoda de separare a proteinelor într-un câmp electric. Metoda este utilizată în laboratorul clinic pentru detectarea valorilor concentraţiei de imunoglobuline şi a altor proteine serice.
Câteva dintre bolile care pot fi diagnosticate, utilizând această tehnică sunt: mielomul multiplu, macroglobulinemia Waldenström şi hipergamaglobulinemia. De asemenea, electroforeza poate fi folosită pentru detectarea modificărilor în compoziţia lichidului cerebro-spinal al pacienţilor cu scleroză multiplă.
1. Imunoelectroforeza foloseşte atât separarea electroforetică, cât şi precipitarea proteinelor. Se poate utiliza atât pentru proteinele specifice (identificare şi dozare) din serul sanguin, cât şi din urină sau alte lichide.
Astfel, o probă de ser este plasată într-un godeu realizat în gelul de agar turnat pe o lamă de sticlă. Un curent electric trece prin agar şi proteinele se deplasează în câmpul electric, conform sarcinii electrice şi dimensiunii lor.
Apoi, în gelul de agar se taie un şanţ care se va umple cu anticorp. Deoarece antigenul şi anticorpul difuzează unul spre celălalt, se vor forma o serie de arcuri de precipitare (fig. 49).
...................................
Fig. 49 -Imunoelectroforeza
...................................
Aceste arcuri permit caracterizarea proteinelor serice în funcţie de: prezenţă/absenţă sau traiectul lor neobişnuit (de exemplu, human myeloma protein).
Metoda este utilă pentru identificarea paraproteinelor cu lanţ greu şi uşor.
Pot fi determinate de asemenea, scăderea sau absenţa imunoglobulinelor în imunodeficienţe, iar originea monoclonală a proteinei Bence-Jones din mielom poate fi confirmată.
Imunelectroforeza este o metodă valoroasă în studiul bolilor autoimune şi neurologice.
2. Radioimunoelectroforeza este utilizată în primul rând ca tehnică de cercetare, care combină imunoelectroforeza cu folosirea antigenelor marcate.
Metoda foloseşte culturi de ţesuturi. Când antigenele marcate reacţionează cu antiserurile antiumane şi antiserurle ce conţin lanţuri grele şi uşoare, se confirmă originea unei proteine specifice (de exemplu proteină de: organ, ţesut sau populaţie celulară crescută în cultură).
3. Contraimunoelectroforeza (CIE) sau electroimunodifuzia dublă combină caracteristicile imunodifuziei în gel şi electroforezei.
Probe din lichidele organismului în care se suspicionează prezenţa agenţilor microbieni sunt plasate în godeuri separate realizate într-un mediu de difuzie tamponat (agaroză). Godeuri similare situate la 3 mm distanţă sunt umplute cu anticorpi cunoscuţi. Prin trecerea unui curent electric, antigenele polizaharidice care au tendinţa de a fi încărcate negativ la pH neutru migrează în direcţia opusă, spre catod.
În 30 - 60 de minute antigenul şi anticorpul se vor întâlni, se vor cupla în caz de specificitate structurală formând o linie de precipitare distinctă. Principiul este acelaşi ca la imuno-dubla-difuzie, dar sensibilitatea metodei este mai mare (de 10-20 de ori).
CIE poate fi utilizată pentru identificarea atât a antigenelor şi a anticorpilor necunoscuţi, de exemplu Ag HBs, a-feto-proteina, polizaharidul pneumococic (în sângele unui pacient cu pneumonie sau în lichidul cefalorahidian al unuia cu meningită), criptococoză, meningită produsă de Haemophylus influenzae, endocardită stafilococică (fig. 50).
...................................
Fig. 50 - Contraimunoelectroforeza
...................................
4. Electroforeza în "rachetă" sau electroimunodifuzia unidimensională implică electroforeza antigenelor dintr-un godeu printr-un mediu de gel cu anticorp fixat.
pH-ul gelului este ales în aşa fel încât anticorpul să fie imobil, iar antigenul să aibă sarcina negativă. Liniile de precipitare care rezultă au forma de "ţeapă" sau "rachetă" iar înălţimea lor este proporţională cu concentraţia de antigen. Principala aplicaţie a acestei tehnici este determinarea cantitativă a antigenelor în lichidele biologice (fig. 51).
...................................
Fig. 51 - Electroforeza in "racheta"
...................................
3. Reacţia de fixare a Complementului (RFC)
Sistemul complement este compus din 20 sau mai multe proteine plasmatice care interacţionează între ele şi cu membrana celulară. Fiecare componentă proteică trebuie să fie activată secvenţial în condiţii potrivite pentru declanşarea reacţiei.
Complexele antigen-anticorp se numără printre activatori şi reactia de fixare a complementului poate fi utilizată pentru identificarea unuia dintre ei, când celălalt este cunoscut.
In situaţia în care reacţia de fixare a complementului urmăreşte detecţia de anticorpi necunoscuţi, procedura este următoare:
(1) Serul de testat (de la pacient) se titrează în dublă diluţie şi se adaugă o cantitate stadardizată de antigen în fiecare tub sau godeu. Dacă anticorpul specific este prezent în serul de testat se vor forma complexele imune.
(2) Apoi, la acest amestec se adaugă complementul (de obicei, obţinut de la porcul de Guineea). Dacă sunt prezente complexele imune, ele vor lega complementul si îl vor "consuma".
(3) În etapa finală, este adăugat sistemul indicator reprezentat de eritrocite sensibilizate [eritrocite de oaie sensibilizate cu anticorpi (în cantitate subaglutinantă) extraşi din ser de iepure] (fig. 52).
...................................
Fig. 52 - Reactia de fixare a complementului
..................................
Interpretarea rezultatului:
- dacă anticorpul se potriveşte antigenului în prima fază a reacţiei, complementul a fost fixat nemaifiind disponibil să se lege de hematiile sensibilizate; astfel, eritrocitele rămân nehemolizate testul fiind interpretat ca pozitiv (hematiile rămân în "dop" la baza tubului de reacţie);
- dacă anticorpul nu se potriveşte cu antigenul (nu există specificitate), complementul este liber şi se leagă la eritrocitele sensibilizate care vor fi lizate, iar testul va fi negativ (aspectul în tubul de reacţie va fi de hemoliză/roşu difuz).
Folosind cantităţi standardizate de anticorp cunoscut şi eşantion de antigen, metoda poate fi utilizată pentru testarea antigenelor.
Complementul trebuie standardizat cu grijă, iar serul de testat trebuie prelucrat în vederea inactivării oricărei activităţi a complementului seric. Efectuarea controalelor recomandate (martorii probei de reacţie) este foarte importantă în această tehnică deoarece anumite preparate de anticorpi folosesc complement fără adăugarea antigenului, de exemplu, dacă este vorba de ser care conţine deja complexe imune. De asemenea, unele antigene pot avea activitate anti-complement. De aceea, controlul trebuie să includă anticorp singur, respectiv antigen singur, pentru a verifica dacă nu cumva unul dintre aceştia nu fixează complementul fără intervenţia celuilalt.
Exprimarea rezultatelor:
- concentraţia anticorpilor este exprimată ca cea mai ridicată diluţie a serului care indică fixarea complementului (diluţie la care nu apare hemoliza)
- concentraţia de antigen este exprimată ca fiind titrul de antigen care limitează acţiunea hemolitică a complementului.
Reacţia de fixarea a complementului este foarte mult utilizată în cercetare şi în laboratoarele clinice în scopul diagnosticării infecţiei cu M. pneumoniae, micozelor, pentru identificarea paraziţilor, virusurilor, a infecţiei cu Treponema pallidum (testul Wassermann).
4. Reacţia de neutralizare
Această reacţie se bazează pe capacitatea anticorpului de a bloca efectul antigenelor toxice, litice sau infectante prin combinaţii specifice dintre antigen şi anticorp "in vivo" sau "in vitro".
Neutralizarea virusurilor
Neutralizarea activităţii virale este cea mai sensibilă şi specifică metodă pentru determinarea identităţii unui izolat şi pentru determinarea anticorpilor specifici în serul pacientului.
Dacă anticorpul neutralizant este prezent, virusul nu poate ataca celulele, iar infectivitatea este blocată. O fracţiune a virusului infectant poate rămâne chiar şi în prezenţa antiserului specific, astfel încât infecţia poate fi mai degrabă amânată, decât blocată complet.
Pentru identificarea izolatelor virale, se folosesc antiserurile specifice cu reactivitate cunoscută. Pentru testarea serologică, suspensia din virusurile de referinţă este testată împotriva serurilor de testat.
Această reacţie se poate folosi pentru evidenţierea:
- efectului citopatic (cel mai frecvent);
- hemadsorbţiei şi hemaglutinării pentru evidenţierea orthomyxovirusurilor şi paramyxovirusurilor;
- inhibiţiei metabolice (colorimetric): acidifierea mediului cu roşu-fenol prin dezvoltarea celulelor, dacă replicarea virusurilor a fost neutralizată;
- reducerii "plăcii": celulele infectate de numeroase virusuri pot fi detectate aşezarea monostratificată cu soluţie de agar nutritiv, care conţine un colorant vital, cum ar fi roşu neutru; celulele infectate apar ca "plăci" necolorate faţă de fundalul roşu format de celulele viabile; reducerea numărului de "plăci" indică reacţia de neutralizare.
Neutralizarea toxină-antitoxină
Când o toxină este pusă în contact cu antitoxina corespunzătoare, efectul toxic al toxinei este neutralizat. Se poate utiliza:
1) In vivo: testul Schick este folosit pentru determinarea susceptibilităţii unui individ la difterie. Prin injectarea intradermică a unei cantităţi mici de exotoxină difterică, toxina este neutralizată de antitoxinele din ser dacă individul respectiv este imun şi nu se produce nici o reacţie. Situaţia inversă este apariţia unei zone erimatoase necrotice în cazul în care individul nu prezintă antitoxine (individul este susceptibil la acestă infecţie).
2) In vitro: testul ASLO (Antistreptolizină "O") - este o reacţie de neutralizare folosită pentru a măsura titrul de antistreptolizină "O"= anticorp induşi de streptolizina "O" un antigen virulent (hemolizina) al bacteriei Streptococcus pyogenes.
Acest test este valoros mai ales pentru confirmarea sau infirmarea diagnosticului de febră reumatică sau glomerulonefrită acută, situaţii în care poate fi determinat, atunci când streptococul (Streptococcus pyogenes de grup A) nu mai este prezent.
Principiul
În acest test, diluţia succesivă dublu seriale a unei probe de ser de la pacient este pusă în contact cu o cantitate de streptolizină "O" standard (Ag) şi, apoi, după o scurtă incubare necesară pentru combinarea specifică, se adaugă o suspensie de eritrocite, ca sistem indicator.
În tuburile (godeurile) în care diluţiile de ser conţin suficientă streptolizină "O" (anticorp) efectul litic al antigenelor este inhibat, ceea ce înseamnă lipsa hemolizei, în timp ce în tuburile (godeurile) în care anticorpii nu sunt suficienţi pentru a neutraliza antigenele, efectul litic al acestora va fi sugerat de prezenţa hemolizei.
Titrul reacţiei este dat de diluţia din ultimul tub (godeu) în care nu se observă hemoliza; valori normale: 166 - 250 U/ml.
Titruri crescute există în boli streptococice şi post-streptococice: angina, scarlatina, febra reumatică, glomerulonefrita acută.
5. Teste care utilizează antigene sau anticorpi marcaţi
Imunofluorescenţă (IF)
Principiul
Proteinele, inclusiv anticorpii serici, pot fi marcaţi folosind coloranţi fluorescenţi (de exemplu, fluoresceina si auramina) prin combinaţii chimice, fără a altera ori a interfera cu proprietăţile biologice sau imunologice ale proteinelor.
Apoi, aceste proteine pot fi observate în preparatele microscopice folosind microscopul cu fluorescenţă (în lumina ultravioletă).
Astfel de anticorpi marcaţi pot fi utilizaţi pentru identificarea antigenelor pe suprafaţa bacteriilor (streptococi, neisserii, treponeme) în celule sau secţiuni histologice ori în alte probe.
Imunofluorescenţa este folosită frecvent pentru detectarea anticorpilor si a autoanticorpilor pentru antigenele tisulare şi celulare (de exemplu, anticorpi antinucleari, anticorpi antimuşchi netezi, anticorpi anticelule parietale). Autoanticorpii apar în bolile autoimune.
Imunofluorescenţa poate detecta anticorpi in situ. Dintr-o masă congelată de ţesut, cu ajutorul criostatului, se realizează o secţiune; aceasta conferă siguranţa că antigenele labile nu sunt distruse de substanţe fixatoare.
Imunofluorescenţa (IF), (fig. 53) poate fi:
...................................
Fig. 53 - Imunofluorescenţa directă şi indirectă
...................................
IMUNOFLUORESCENŢĂ DIRECTA, când anticorpul marcat cunoscut interacţionează direct cu un antigen necunoscut şi se foloseşte, în mod obişnuit, pentru detectarea antigenului.
Anticorpul specific este conjugat cu un compus fluorescent (de obicei, izotiocianat de fluoresceină), rezultând un sistem trasor vizibil cu reactivitate imunologică nealterată.
Serul conjugat este adăugat la celule sau ţesuturi pe o lamă şi se fixează pe antigen, formând un complex imun stabil. Substanţele care nu au participat la reacţie sunt îndepărtate prin spălare, apoi preparatul este colorat şi examinat la microscopul cu fluorescenţă. Antigenul specific legat la anticorpul fluorescent poate fi observat ca un element strălucitor de culoare verde deschis sau galben-portocaliu pe fond întunecat, în funcţie de fluorocrom şi de filtrele utilizate. Aspectul fluorescenţei este caracteristic pentru fiecare antigen tisular.
IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA. În acest test se foloseşte un proces cu două etape. Un antigen cunoscut se fixează pe lamă, se adaugă ser necunoscut, apoi preparatul este spălat; dacă anticorpul seric necunoscut corespunde antigenului, va rămâne fixat pe acesta pe lamă şi va putea fi detectat prin adăugarea unui anticorp antiglobulină marcat fluorescent şi examinarea cu ajutorul microscopului cu fluorescenţă.
Imunofluorescenţa indirectă este de multe ori mai sensibilă decît cea directă, deoarece pe locul antigenului aderă mai mulţi anticorpi marcaţi. În plus, antiglobulina marcată devine un "reactiv universal" independent de antigenul utilizat, va intra în reacţie cu toate imunoglobulinele G ale acelei specii.
Teste cu marcaj enzimatic (ELISA)
Există multe variante ale acestei metode în funcţie de legarea unei enzime de antigen sau anticorp. Enzima este detectată prin testarea activităţii enzimatice cu substratul său.
Pentru măsurarea anticorpului, se foloseşte metoda indirectă: antigene cunoscute se fixează pe un suport solid (de exemplu, microplăci din material plastic) se incubează cu diluţii din serul de testat, se spală, apoi se reincubează cu o anti-imunoglobulină marcată cu o enzimă (de exemplu, fosfataza alcalină, peroxidaza).
Activitatea enzimatică este măsurată prin adăugarea unui substrat enzimatic, care -în general- determină formarea unui produs colorat, care poate fi detectat vizual sau cu ajutorul spectrofotometrului. O reacţie pozitivă indică faptul că anticorpul a fost prezent în proba, iar intensitatea reacţiei este proporţională cu concentraţia de anticorpi din produs (fig. 54).
...................................
Fig. 54. Testul ELISA - metoda indirectă
1. Antigen adsorbit pe faza solida; 2. Anticorp de testat, in ser; 3,5. Spalare; 4. Antiglobulina marcata enzimatic; 6. Substrat; 7. Intensitatea de virare a culorii
.
Pentru a măsura un antigen se foloseşte metoda cu doi anticorpi, specifici unul faţă de altul.
Un anticorp cunoscut este fixat pe un suport solid. Se adaugă proba de testat care conţine antigenul, iar excesul se spală. Se adaugă un anticorp specific marcat enzimatic.
După o nouă spălare, se adaugă un substrat şi activitatea enzimatică este măsurată colorimetric şi raportată la concentraţia antigenului (fig. 55).
...................................
Fig. 55 - Tehnica identificării unui antigen - test ELISA
1. Anticorp adsorbit pe faza solida; 2. Antigen de testat; 3,5. Spalare; 4. Anticorp specific marcat enzimatic; 6. Substrat; 7. Intensitatea de virare a culorii
...................................
Tehnica Western blot este o variantă a metodei ELISA. În această tehnică, proteinele virale separate prin electroforeză în funcţie de greutatea lor moleculară sau sarcina electrică sunt transferate (blotted) pe o hârtie de filtru (de exemplu, nitroceluloză, nylon). Când hârtia este expusă serului unui pacient, proteinele imobilizate capturează anticorpul viral specific şi este vizualizat cu ajutorul unui anticorp antiuman legat enzimatic.
Tehnica Western blot este utilizată pentru a confirma rezultatele obţinute prin ELISA la pacienţii suspectaţi că ar fi infectaţi cu HIV, hepatite virale.
Radioimundozarea (Radio Immune Assay)
Principiul de bază al radioimunotestării este similar celui prezentat la testul ELISA. Diferenţa esenţială este aceea că markerul utilizat la ELISA este o enzimă, iar cel folosit în RIA este un izotop radioactiv (I125, P32). Etapa finală a acestei metode o reprezintă detectarea activităţii radioactive cu ajutorul unui contor de scintilaţie, care sesizează atât emisiile β, cât şi pe cele γ.
Deşi are un grad ridicat de sensibilitate şi specificitate, această metodă prezintă dezavantajul că este costisitoare, reactivii expiră repede (short-life), iar în ceea ce priveşte izotopul este necesară îndeplinirea unor condiţii deosebite.
Cele mai multe variante RIA folosesc un sistem de testare competitiv. În testul cantitativ pentru anticorpi, suportul solid este întâi standardizat prin legarea unui antigen nemarcat şi o concentraţie standard pentru anticorp care este marcat cu o substanţă radioactivă.
Proba (necunoscută) care conţine anticorpul ce trebuie testat (şi care este nemarcat) se adaugă la mediul de reacţie. Concentraţia anticorpului în proba necunoscută este determinată prin citirea comparativă a valorilor pe o curbă standard.
Curba e funcţie de gradul de inhibiţie a legării anticorpului marcat combinat cu valorile diluţiilor în serie ale cantităţilor cunocute de anticorp nemarcat.
Metoda de lucru este similară când antigenele sunt cele care se detectează, cu excepţia situaţiei în care antigenul marcat este folosit pentru dozarea antigenului liber în probă.
RIA se foloseşte pe scară largă în chimia clinică, endocrinologia clinică şi toxicologie, dar nu reprezintă un test de rutină în microbiologia clinică. În practica curentă, metodele RIA includ teste pentru hormoni steroizi (cum ar fi aldosteronul, cortizonul, progesteronul) hormoni peptidici (corticotropina, hormonul corticostimulant, vasopresina).
În unele laboratoare se mai utilizează metoda RIA pentru testarea markerilor pentru hepatita B (Ag HBs, Ac HBs, Ac HBc, Ag Hbe, Ac HBe) dar a fost, în genral, înlocuită de tehnica ELISA.
Testul RAST (radioallergosorbent test) este o variantă specializată a RIA, utilizată pentru a măsura cantitatea de anticorpi IgE serici care reacţionează cu un alergen cunoscut (antigen).
II. in vivo
Intradermoreacţia (test cutanat)
1. Prick - test-ul este un test uşor de efectuat şi foarte eficient în diagnosticul diferitelor alergii. Alergenii introduşi la nivel tegumentar (de obicei la nivelul antebraţului) în câteva minute induce eliberarea de mediatori preformaţi ce cauzează secundar vasodilataţie locală, edem local şi prurit. Acest tip de reacţie caracterizează hipersensibilitatea de tip I.
Testul este pozitiv la pacienţii cu o varietate mare de tulburări atopice şi de obicei se corelează cu testul RAST (Radioallergosorbent test) pozitiv pentru IgE seric specific şi testul de provocare cu alergeni specifici, pozitiv la nivelul mucoasei nazale sau bronşice.
Faptul că aceşti pacienţi cu tulburări atopice dezvoltă o reacţie imediată la locul de inoculare (prick test) demostrează că molecule de IgE sunt fixate pe suprafaţa celulelor mastocitare, chiar dacă simptomatologia este nazală sau bronhială.
2. Patch test-ul implică aplicarea alergenului pe suprafaţa normală tegumentară ştearsă în prealabil. De exemplu pacienţii cu eczemă atopică ce posedă Ac specifici (IgE) faţă de acarienii din praful de casă, vor dezvolta un patch test pozitiv.
Este interesant că o parte din pacienţii cu rinită alergică cauzată de praful de casă (ce conţine acarieni) dezvoltă o reacţie patch pozitivă la acest allergen, manifestat printr-un infiltrat bazofilic local, sugerând faptul că infiltrarea nu este specifică eczemei atopice.
Keratina de suprafaţă a unei zone neafectate este îndepărtată printr-o ştergere uşoară şi extractul este plasat pe tegument, într-o manieră ocluzivă, pentru 48 de ore, după care urmează examinarea locală. Leziunile ce apar sunt macroscopice eczematoase, iar microscopic conţin infiltrate de eozinofile şi bazofile.
Metode de izolare a anticorpilor
Cercetătorii imunologi au deseori nevoie de izolate pure de anticorpi, care pot fi imunoglobuline nespecifice sau antigen nespecifice.
Izolarea imunoglobulinelor nespecifice din ser, se poate obţine prin fracţionare secvenţială a proteinelor serice, etape ce includ :
- precipitarea gama-globulinelor - în soluţie de 30-50% sulfat de amoniu
- filtrarea gelului, pentru obţinerea de molecule de dimensiuni corecte
- cromatografie de schimb ionic - pentru a izola moleculele care sunt încărcate pozitiv, la un pH neutru.
- Cromatografia de afinitate pentru liganzii naturali ai imunoglobulinelor, cum sunt proteina A (proteina A fiind un component al peretelui celular al Stafilococului, ce are capacitatea de a lega regiunile Cγ2 şi Cγ3 a majorităţii subclaselor de IgG, de exemplu: IgG1, IgG2 şi IgG4).
Izolarea anticorpilor antigen-specifici se poate realiza prin cromatografia de afinitate, utilizându-se antigenul cuplat cu Sepharoză ; anticorpul pur este izolat prin metoda imunoabsorbantă.
Producerea de anticorpi monoclonali
Intenţia tehnicilor serologice imunologice sunt de a reduce heterogenicitatea antiserurilor utilizate în terapie.
Moleculele de antigen ce posedă un singur epitop sunt rar întâlnite de-a lungul vieţii unui individ. Cele mai multe antigene, conţin sute chiar mii de determinanţi antigenici ce exisţă pe suprafaţa celulară sau în interiorul unor mixturi de substanţe. Când aceşti antigeni mixaţi sunt injectaţi unui animal, un număr egal de clone limfocitare sunt stimulate. Chiar dacă fiecare clonă produce un anticorp specific, rezultatul final este o mixtură heterogenă de molecule de anticorpi, a cărei specificitate şi afinitate este deseori necunoscută şi dificil de a fi controlată.
Când aceste seruri policlonale sunt utilizate în sistemele de testare bacteriene, pot apare cross-reacţii, fie din cauza determinanţilor antigenici care se regăsesc la diferite specii sau din cauza mutaţiilor care pot induce apariţia unor epitopi suficient de apropiaţi ca specificitate pentru a produce reacţii detectabile.
Intenţia de a produce antigene pure prin tehnici de absorbţie au avut parte de un succes parţial.
Cum ştiinţa testării serologice a evoluat, impresia a fost că disponibilitatea unui anticorp ce posedă un grad înalt de heterogenicitate moleculară cu o specificitate îngustă pentru un singur epitop antigenic, fără dezvoltarea unor cross-reacţii, ar putea rezolva multe din problemele cu care se confruntă utilizarea anticorpilor monoclonali.
Specificitatea înaltă a anticorpilor monoclonali, ca şi produs al unei singure clone de celule limfoide, s-a putut obţine prin investigaţii în fuziunea celulară şi tehnologia hibridoamelor, cercetări efectuate pe şoarecei, de Kohler şi Milstein.
Prin descoperirile acestor 2 oameni de ştiinţă, este acum posibil să se izoleze linii de clone a unui singur limfocit care este capabil să producă un singur tip de moleculă de anticorpi.
Cea mai mare realizare a fost nu numai izolarea unei singure linii celulare capabile să sintetizeze un singur tip de moleculă de anticorp ci şi fuzionarea acestor limfocite de şoarece cu celule din mielomul de şoarece, cu intenţia reuşită de a produce celule hibride (fig. 56) cu 2 caractere moştenite importante:
- capacitatea de a produce anticorpi monospecifici (achiziţionaţi de la limfocitele parentale) şi
- abilitatea de a creşte continuu în cultură, caracter de imortalitate moştenit de la linia de celule mielomatoase.
Animalele (de obicei şoareci sau şobolani) sunt imunizaţi cu un antigen. Odată ce animalele dezvoltă un răspuns imun eficient, sunt splenectomizate şi se prepară o suspensie celulară (se utilizează de asemenea ganglionii limfatici).
Aceste celule sunt fuzionate cu linii celulare din mieloame, prin adiţia de PEG (Poliethylene glycol) are are rolul de a promova fuziunea membranelor celulare. Numai o mică parte a acestor celule vor fuziona (frecvenţa este de 1/105 sau 1/106).
Mixtura fuzionată este transferată într-o cultură ce conţine "HAT" care este o mixtură de hipoxantină, aminopterin şi timidină..
În aceste condiţii celulele splenice pot creşte în mediul cu "HAT", în timp ce celulele mielomatoase mor în aceste condiţii, din cauza defectului metabolic ce nu le permite utilizarea acestor metaboliţi.
Mediul cu "HAT" în acest moment conţine: celule splenice, celule mielomatoase şi celule fuzionate. Celulele splenice mor în acest mediu, în mod natural după 1-2 săptămâni iar celulele mielomatoase sunt distruse de prezenţa "HAT".
Celulele fuzionate supravieţuiesc oricum, din cauza "imortalităţii" bodândite de la celulele mielomatoase.
Unele dintre aceste celule care supravieţuiesc au capacitatea de a produce anticorpi la fel ca şi celulele splenice.
Prin tehnici imune, godeurile în care sunt culturile celulare, sunt testate în scopul identificării anticorpilor doriţi. Şi dacă se reuşeşte identificarea, urmează clonarea celulei din godeul în care s-a identificat anticorpul dorit.
Clona care rezultă dintr-un singur progenitor, posedă caracter de imortalitate şi are capacitatea de a produce anticorpi monoclonali.
..................................
Fig. 56. Producerea de anticorpi monoclonali
...................................
B. Testele pentru evaluarea imunităţii mediate celular
Evaluarea competenţei imune
Diferite teste s-au dezvoltat pentru evaluarea funcţiei sistemului imun celular. Aceste teste include teste cutanate destinate identificării Hipersensibilităţii întârziate tip IV, evaluări ale funcţiei limfocitelor T şi B, determinări ale funcţiilor limfocitelor şi neutrofilelor.
Multe din aceste proceduri sunt supuse variabilităţii biologice astfel standardizarea lor fiind dificilă. Oricum evaluările furnizează date importante despre funcţia celulară în infecţiile cu patogeni intracelulari, în imunologia tumorilor şi rejetului de transplant.
Evaluarea competenţei celulelor T şi B, ca şi funcţia celulelor fagocitare au o importanţă primordială în determinarea statusului imun al unui individ cu infecţii cronice, sindroame de imunodeficienţă sau pacienţi cu terapii imunosupresive (în patologia malignă).
1. Teste cutanate DTH (delayed T hypersensitivy)
Imunocompetenţa şi expunerea la anumiţi agenţi infecţioşi pot fi măsurate prin testul cutanat. Aceste proceduri sunt simplu de efectuat şi dacă sunt interpretate corect, pot fi utilizate în practica medicală.
Există 2 tehnici de testare cutanată: fie injectarea intradermică a antigenului, fie testul prin contact direct. Aceste teste pot fi interpretate la 24-72 de ore de la efectuare.
a. injectarea intradermică a antigenului - s-a utilizat în special pentru evaluarea statusului imunocompetent şi a contactului cu agentul etiologic în diferite infecţii, cum sunt: tuberculoza, lepra, bruceloza, varicela, limfogranulomatoza veneriană, psitacoza, bola hidatică, leishmanioza, afecţiuni fungice.
b. teste de contact sunt efectuate prin plasarea antigenului pe suprafaţa tegumentară şi acoperirea zonei cu un plasture; testul este util în determniarea hipersensibilităţii la diferite produse: cosmetice sau săpunuri.
Interpretarea corectă a rezultatelor este punctul critic al testelor cutanate.
Indurarea în jurul locului de injectare, este rezultatul infiltratului mononuclear şi al edemului. Această reacţie apare la 24-48 de ore după ce se efectuează testul. Diametrul zonei de indurare este un indicator al intensităţii răspunsului imun celular împotriva antigenului testat.
Eritemul (bine delimitat) de la locul inoculării este un indicator al hipersensibilităţii imediate. Deobicei dispare la 12-18 ore dar poate persista perioade mai lungi de timp. Reacţia eritematoasă nu ar trebui luată în considerare în interpretarea testului cutanat.
În cazul copiilor testele au o valoare mai mică şi nu sunt recomandate, mai ales în cursul primului an de viaţă. Copiii probabil nu au fost îndeajuns de expuşi la antigene cât să-şi dezvolte un răspuns adecvat, astfel putând fi sensibilizaţi în momentul injectării antigenului.
Pacienţii imunosupresaţi cum sunt indivizii cărora li s-a efectuat un transplant, deobicei sunt anergici şi lipseşte răspunsul la acest test.
Reacţiile adverse la testele cutanate pot apare la indivizi hipersensibilizaţi şi imunizaţi. Reacţii locale severe reprezentate de eritem, induraţie şi necroză se pot de asemenea dezvolta. Simptomele sistemice cum sunt: febra şi reacţia anafilactică sunt rare.
2. Evaluarea limfocitelor
Identificarea şi evaluarea funcţiei celulelor T şi B la nivelul sângelui periferic este foarte importantă în diagnosticarea bolilor însoţite de imunodeficienţe, boli autoimune şi în reacţii imune în patologia tumorală.
Metodele disponibile pentru separarea limfocitelor şi a subpopulaţiilor specifice includ: separarea pe gradient de densitate, sortarea celulelor activate prin utilizarea fluorescenţei, panning-ul, rozetarea, separarea magnetică.
Separarea în gradient de densitate - se bazează pe faptul că limfocitele sunt mai puţin dense decât eritrocitele şi granulocitele (fig. 57) şi este utilizată pentru a izola majoritatea limfocitelor sanguine.
..................................
Fig. 57. Separarea pe baza gradientului de densitate a limfocitelor
...................................
Sângele total este defibrinat prin agitare într-un recipient cu bile de sticlă iar cheagul care rezultă este îndepărtat. Apoi sângele este diluat într-un mediu de cultură tisulară şi stratificat într-o eprubetă plină pe jumătate cu soluţie Ficoll. Ficoll are o densitate mai mare decât cea a limfocitelor dar mai mică decât a eritrocitelor şi granulocitelor.
După centrifugare eritrocitele şi polimorfonuclearele neutrofile vor trece în parte inferioară a porţiunii cu Ficoll formând un depozit la fundul eprubetei, în timp ce limfocitele se aşează la interfaţa mediului cu Ficoll.
Prepararea limfocitelor poate continua prin îndepărtarea macrofagelor şi PMN reziduale prin adiţie de fier, care va fi ingerat de fagocite, care vor ptea fi îndepărtate prin acţiunea unui magnet.
Macrofagele pot fi îndepărtate prin lăsarea suspensiei celulare să se aşeze pe un platou de plastic. Macrofagele vor adera de plastic, în timp ce limfocitele vor putea fi îndepărtate prin spălare.
Sortarea celulelor activate prin fluorescenţă
Disponibilitatea anticorpilor monoclonali faţă de o multitudine de antigene şi dezvoltarea flow-citometriei a dus la apariţia unei metode foarte eficiente de studiu a clasificării celulare.
În această tehnică, recunoscută ca şi sortarea celulelor activate prin fluorescenţă, anticorpii marcaţi cu substanţe fluorescente sunt incubaţi mai întâi cu o populaţie celulară.
Celulele conţin antigene specifice pe suprafaţa lor şi se vor lega de anticorpii marcaţi; celulele sunt diluate excesiv înainte de a fi inoculate într-o singură picătură celulară; citometrul scanează fiecare picătură cu o excitaţie intensă tip laser.
Fluxul celular ce traversează laser-ul are o rată de peste 5000 celule per minut iar analiza se efectuează electronic.
Dacă celula este marcată, va fi fluorescentă şi poate fi separată sau sortată prin deflecţie electrostatică.
Lumina ce rezultă în cursul scanării dă informaţii despre mărimea celulelor şi densitatea antigenelor de suprafaţă.
Citometrele cu fascicol dual, oferă informaţii în plus prin scanarea a 2 antigene diferite sitate pe aceeaşi celulă.
Instrumentele utilizate sunt foarte sofisticate şi necesită o mentenanţă foarte atentă pentru obţinerea de rezultate optime (fig. 58).
Citometrul oferă informaţii asupra lungimii vieţii celulelor, în timp ce tehnicile microscopice necesită distrugerea şi fixarea celulelor pe lame speciale care pot altera antigenele de suprafaţă.
Oricum, antigene intracelulare trebuie să fie analizate cu metode microscopice. Se fac eforturi continue pentru a se îmbunătăţi calitatea anticorpilor monoclonali pentru a furniza informaţii corecte despre histologia, structura celulară şi localizarea antigenelor.
Flow citometria poate efectua o analiză diferenţiată a celulelor albe sanguine furnizând informaţii despre numărul celulelor B (cu CD19, CD 20 şi HLA-DR pe suprafaţa lor) celulelor T (CD3), celulelor Th (CD4) şi limfocitelor Tc şi Ts (CD8).
Această tehnică este de asemenea utilă pentru analiza unor antigene prezente pe celulele maligne în anumite patologii hemoproliferative (fenotiparea celulelor tumorale pentru diagnostic şi clasificarea leucemiilor şi limfoamelor, evaluarea şi prognosticul unei boli maligne, determinarea aneuploidiei ADN-ului).
..................................
Fig. 58. Sortarea celulelor activate prin fluorescenta
..................................
Această metodă mai oferă informaţii despre numărul celulelor T, al raportului CD4/CD8 care este foarte important în sindroamele imunodeficienţelor, dar mai ales în SIDA.
Rozetarea
Se bazează pe faptul că unele populaţii limfocitare au receptori pentru eritrocite. Celulele T umane au receptori pentru eritrocitele de oaie (E) reprezentate de moleculele CD2. Când sunt amestecate celulele T cu aceste eritrocite, se formează rozete astfel se pot separa de limfocitele ce nu formează rozete, reprezentate de limfocitele B (fig. 59) pe gradient Ficoll.
...................................
Fig. 59.Izolarea subpopulaţiilor limfocitare prin rozetare
...................................
O modificare adusă acestei tehnici permite să se izoleze celulele cu alţi receptori, de exemplu unele celule T (celulele Tγ) au receptori pentru fragmentul Fc al IgG (Fcγ).
Aceste celule pot fi identificate şi izolate prin rozetare cu eritrocite de bou, sensibilizate cu anticorpi anti eritrocite de bou.
"Panning"
Populaţiile celulare pot fi separate pe platforme sensibilizate cu anticorpi. Anticorpii se leagă non-covalent la suprafaţa de plastic (ca în cazul unei tehnici imune pe fază solidă) şi mixtura celulară pe aplică pe platformă.
Celulele antigen (+) se leagă de anticorpi iar celulele antigen (-) pot fi îndepărtate prin spălare.
Prin schimbarea condiţiilor de cultură sau prin digestie enzimatică celulară pe suprafaţa platformei uneori este posibil să se recupereze celulele ce s-au fixat pe suprafaţă.
Astfel, metoda este mult mai eficientă pentru îndepărtarea unei subpopulaţii celulare, mai degrabă decât izolarea ei.
De exemplu se poate utiliza pentru separarea CD4 de CD8 şi separarea Th de Ts prin utilizarea de anticorpi anti Ig care se leagă la suprafaţa anticorpului de pe celula B.
Prin sensibilizarea platformei cu molecule de antigen, celulele ce se vor lega de acesta pot fi separate dintre celulele care nu s-au legat de antigen (fig. 60).
...................................
Fig. 60.Iizolarea subpopulaţiilor limfocitare prin metoda "panning"
...................................
Separarea magnetică
Această metodă utilizează bile magnetice îmbrăcate în anticorpi specifici (de exemplu anticorpi anti CD4); bilele sunt amestecate cu populaţia celulară şi se leagă de acelea care recunosc anticorpul. Aceste celule pot fi apoi îndepărtate sau izolate prin aplicarea unui câmp magnetic.
O altă metodă utilă pentru îndepărtarea populaţiilor celulare care nu reprezintă interes, se bazează pe anticorpi şi pe sistemul Complement. Când un anticorp specific (de exemplu CD8) este adăugat la o mixtură celulară, urmată de adăugare de Complement, acea subpopulaţie celulară va fi lizată; în mod natural această metodă se aplică doar anticorpilor care fixează Complementul şi unde populaţia celulară ţintă are suficiente antigene pentru a fixa Complementul în doză litică.
Evaluarea competenţei celulelor T
Enumararea celulelor T
1. enumerarea numărului total al celulelor T poate fi efectuată prin utilizarea anticorpilor monoclonali la CD3 conjugat cu substanţe cu fluorescenţă. Celulele sunt numărate prin microscopie cu fluorescenţă sau prin flow citometrie; subsetul celulelor T poate fi numărat prin utilizarea anticorpilor monoclonali faţa de CD4 sau CD8.
2. metoda rozetelor -E poate fi utilizată pentru numărarea celulelor T: celulele T au receptori pentru eritrocitele de oaie; dacă limfocitele din sângele periferic sunt amestecate cu o suspensie de eritrocite de oaie, celulele T se vor lega de eritrocitele de oaie şi vor forma rozete ce pot fi numărate la microscopia optică.
Evaluarea funcţiei celulelor T
Transformarea limfoblastică
În mod normal, celulele T funcţionale se transformă în celule blastice mari, cu o intensificare a sintezei ADN-ului, când sunt expuse la fitohemaglutinină (o substanţă mitogenică) sau concavalina A (un extract de plante care stimulează în mod specific celulele T). Gradul mitozei este măsurat prin gradul de încorporare a timidinei triturate la mediul de reacţie, apoi se măsoară prin scintilaţie spectrometrică.
Evaluarea competenţei limfocitelor B
Enumerarea limfocitelor B
1. prin tehnici imunofluorecente prin utilizarea anticorpilor policlonali marcaţi cu fluoresceină sau prin flow citometrie
2. antiseruri monoclonale împotriva lanţurilor grele sau uşoare, se pot utiliza pentru evaluarea subclaselor limfocitelor B
3. rozete EA sau EAC: celulele B au receptori pentru C3 şi Fc a moleculei de anticorpi astfel pot forma rozete cu eritrocitele de oaie mbricate cu anticorpii lor (EA); de asemenea pot forma rozete cu eritrocitele de oaie îmbrăcate cu anticorpi şi Complement (EAC) şi pot fi numărate la microscop.
Testele pentru evaluarea funcţiilor celulelor B
2. transformarea limfocitară; în mod normal celulele B funcţionale pot fi stimulate să se transforme în celule blastice mari cu sinteză crescută de ADN, când sunt expuse la LPS (lipopolizaharid). Acesta poate fi măsurat prin gradul de încorporare a timidinei triturate adăugate la mediul de reacţie
3. determinarea nivelului imunoglobulinelor prin electroforeza poteinelor; o scădere sau o creştere a gamma-globulinelor poate atrage atenţia asupra unei sinteze anormale de anticorpi
4. cuantificarea diferitelor tipuri de imunoglobuline, prin diferite metode: RIA, ELISA, IF etc
5. imunizarea activă poate fi utilizată in vivo, pentru a testa capacitatea de a produce anticorpi. De exemplu, persoana este imunizată cu trivaccinul DiTePer (anti diftero-tetano-pertusis) apoi este testat prin testul Schick pentru a se evalua dezoltarea imunităţii antidifterice.
Evaluarea funcţiei fagocitare
1. evaluarea chemotaxiei este efectuată prin testarea capacitătii celulelor fagocitare de a migra prin membrane spre substanţa chemotactică
2. evaluarea digestiei sau fagocitozei este efectuată prin vizualizare directă a numărului de particule ingerate utilizând microscopul
3. evaluarea ingestiei şi/sau distrugerea intracelulară prin utilizarea testului de reducere cu NBT (nitro blue tetrazolium). În mod normal celulele fagocitare când sunt stimulate (de exemplu de endotoxină) ingeră colorantul şi îl reduce (virarea culorii din galben în albastru). În condiţii anormale capacitatea de distrugene intracelulară este asociată cu scăderea testului de reducere.
Evaluarea sistemului Complement
Cea mai simplă măsură a activităţii Complementului este determinarea concentraţiei serice, care induce liza a 50% din preparatul standardizat de eritrocite sensibilizate cu anticorpi (EA). Acest test se poate efectua în godeuri sau în eprubete.
Un sistem simplu care furnizează o măsură a activităţii Complementului este hemoliza radială. Tehnica este similară cu cea a imunodifuziei radiale, cu excepţia faptului că godeurile conţin un ser test şi gelul conţine EA.
O zonă de hemoliză se dezvoltă în jurul godeului şi mărimea acestei zone este proporţională cu cantitatea de Complement din godeu. Această tehnică măsoară activitatea totală a căilor clasică şi litică (C1-C9) dar dacă serul prezintă o deficienţă a Complementului, nu se poate identifica care dintre proteine lipseşte.
Componentele individuale pot fi măsurate separat pentru a determina fie nivelul total fie nivelul funcţional.
Aceasta este o distincţie foarte importantă atât timp cât un component poate fi prezsent în cantităţi normale dar nefuncţional.
Nivelul total al proteinelor sistemului Complement este deobicei măsurat cu RIA (Radio Immune Assay) sau prin tehnica ELISA, prin utilizarea unui anticorp specific pentru proteina care este investigată.
Nivelele funcţionale sunt măsurate pentru a detecta fiecare componentă proteică a Complementului, prin furnizarea unui cocktail de celule roşii sensibilizate plus toate componentele necesare pentru liză, cu excepţia celei care este investigată.
